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A remoção incompleta de parafina não representa uma causa de coloração de fundo.
Qualquer coloração que não é resultado da reação antígeno/anticorpo é denominada de coloração de fundo específica.
A incubação das lâminas em uma câmara úmida é aconselhável em qualquer temperatura, pois, se uma lâmina tratada com o anticorpo primário ficar seca, tem-se como resultado uma coloração de fundo.
O tempo de incubação depende da sensibilidade e concentração do anticorpo primário, bem como da qualidade do tecido.
O pH e a composição química das soluções usadas para recuperação antigênica não são importantes na reação imuno-histoquímica.