Considerando as técnicas de imunoprecipitação e imunoblote (Western blotting), analise as afirmativas a seguir.

I. O imunoblote, como a imunoprecipitação, é usado para identificação da presença de uma determinada proteína em um lisado celular, mas evita o problema de marcar grandes quantidades de células com radioisótopos.

II. Todas as proteínas de uma célula podem ser marcadas metabolicamente acrescentando aminoácidos radioativos no meio de cultura, que serão incorporados às proteínas celulares. Outra opção consiste na marcação apenas de proteínas de superfície celular por radioiodinação sob condições que impedem o iodo de cruzar a membrana plasmática e marcar proteínas intracelulares.

III. As células não-marcadas são colocadas em solução de NaOH 2M para solubilizar todas as proteínas celulares, e o lisado é submetido a SDS-PAGE para separar as proteínas. As proteínas, separadas por tamanho, são, então, transferidas do gel para um suporte estável, tal como agar-agar. Proteínas específicas podem ser detectadas por anticorpos capazes de reagir com proteínas solubilizadas por SDS, sendo os anticorpos ligados revelados com antígenos anti-imunoglobulina marcados com radioisótopos ou com uma célula que carrega o gene do anticorpo marcado. Este processo é conhecido como imunoblote (immunoblotting ou Western blotting).

Assinale:

Dois ensaios de ligação direta para anticorpos, de uso comum, são o radioimunoensaio (RIA-radioimmuno assay) e o ensaio imunoenzimático (ELISA-enzyme-linked immunosorbent assay). Considere as afirmativas a seguir.

I. Os dois métodos usam o mesmo princípio, mas o meio de detectar a ligação específica é diferente. O RIA é normalmente usado para medir os níveis de hormônio no sangue e em fluidos teciduais, ao passo que o ELISA é frequentemente usado no diagnóstico viral, por exemplo, para detectar casos de infecção por HIV.

II. No RIA para um antígeno, um anticorpo puro contra o antígeno é marcado radioativamente, em geral com I125. Para o ELISA, uma enzima é quimicamente ligada ao anticorpo. O componente não-marcado, que nesse caso é o antígeno, é ligado a um suporte sólido, tal como um poço de uma microplaca, que irá adsorver uma certa quantidade de qualquer proteína.

III. A ligação do anticorpo, no RIA, é medida diretamente pela quantidade de radioatividade retida nos poços, ao passo que no ELISA a ligação é medida por uma reação que torna um substrato incolor em um produto colorido. A mudança de cor pode ser lida diretamente na placa onde ocorreu a reação, facilitando a coleta de dados.

Assinale:

O Haemophilus influenzae (Hi) é uma bactéria não móvel, estritamente patogênica para os seres humanos, que se abriga comumente no trato respiratório superior. É um organismo gram negativo pleomórfico, podendo variar de pequenos cocobacilos a longos filamentos. As cepas do Hi são capsuladas ou não capsuladas. Entre as capsuladas, diferenciam-se seis sorotipos: a, b, c, d, e, f, baseados na estrutura antigênica dos polissacarídeos capsulares. Apesar de que, tanto as cepas capsuladas como as não capsuladas (não tipificáveis) podem causar doença, as do sorotipo b são responsáveis por mais de 90% das doenças severas em crianças menores de cinco anos. O polissacarídeo do tipo b é um polímero de D-ribose-ribosil fosfato, também conhecido com PRP. O polissacarídeo capsular é o principal fator de virulência das cepas capsuladas, porém existem outros como os lipopolissacarídeos, as proteases para IgA e algumas proteínas da membrana externa. O tipo b é responsável por mais de 95% das infecções invasivas devidas em crianças menores de cinco anos, sendo a meningite uma das mais graves, cujo pico de incidência ocorre entre crianças de seis meses a dois anos de idade. A meningite por Hib tem grande importância para a Saúde Pública por suas características epidemiológicas: alta letalidade nos menores de um ano e transmissibilidade favorecida em locais de aglomeração como as creches. A fonte de microorganismos invasivos é habitualmente a flora bacteriana que coloniza a nasofaringe e/ou a orofaringe. Estima-se que cerca de 3 a 5% das crianças menores de cinco anos na população geral hospedem este microorganismo na nasofaringe, enquanto que em comunicantes da mesma faixa etária, este percentual pode chegar de 14 a 22%. A colonização pode persistir na orofaringe por muitos meses. A transmissão se dá pessoa a pessoa via aerossóis e/ou secreções orais. Em geral, um período longo de portador, com colonização das mucosas respiratórias é a regra para a posterior doença invasiva.

No que tange ao desenvolvimento de vacinas contra bactérias encapsuladas como Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae e Neisseria meningitidis, o antígeno de maior eficiência para formulação de vacinas é o próprio polissacarídeo componente da capsula e principal fator de virulência. Vacinas com esta formulação são designadas vacinas de polissacarídeos. No caso específico de Hib, a vacina é então composta do polissacarídeo que corresponde a subunidade constitutuiva da cápsula. Estas vacinas não induzem a produção de anticorpos em crianças com menos de um ano, considerado grupo de alto risco, pois o sistema imunológico se encontra em processo de maturação. Quando estes polissacarídeos são conjugados quimicamente a proteínas carreadoras, os novos antígenos são capazes de serem reconhecidos pelas células T e macrófagos, gerando uma resposta imune característica dos antígenos T-dependentes e tornam-se eficientes para os grupos de alto risco.

A esse respeito, analise as afirmativas a seguir.

I. Diversos métodos de conjugação estão descritos na literatura sendo que a maioria desses métodos inclui a inserção da molécula espaçadora entre o polissacarídeo e a proteína. As principais metodologias clássicas de conjugação são: o método do brometo de cianogênio, método da carbodiimida e aminação redutiva.

II. O método do brometo de cianogênio compreende a ativação randômica das hidroxilas do polissacarídeo que podem reagir diretamente com aminogrupos (das proteínas, por exemplo) formando o conjugado ou reagir com espaçadores moleculares como as hidrazidas.

III. O método da aminação redutiva prevê a ligação dos radicais aldeídos (gerados pela oxidação das hidroxilas) ao aminogrupo da proteína formando o conjugado. Esta metodologia, muitas vezes, implica na adição de agentes bactericidas para prevenção de crescimento de bactérias que possam contaminar a solução, pois o tempo da reação para a formação do conjugado costuma ser muito curto (cerca de cinco horas).

Assinale: